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蛋白的3種提取方法

更新時間:2022-05-17  |  點擊率:2587
  1.單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取
 
  倒掉培養(yǎng)液,并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液(或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫菏箽堄嗯囵B(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走)。
 
  每瓶細(xì)胞加3ml 4℃預(yù)冷的PBS(0.01M pH=7.2~7.3)。平放輕輕搖動1min洗滌細(xì)胞,然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次,共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。
 
  按1ml裂解液加10μl PMSF(100mM),搖勻置于冰上。(PMSF要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合。)
 
  每瓶細(xì)胞加400μl含PMSF的裂解液,于冰上裂解30min,為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動。
 
  裂解完后,用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)(動作要快),然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。(整個操作盡量在冰上進(jìn)行。)
 
  于4℃下12000 rpm離心5min。(提前開離心機預(yù)冷)將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5min的離心管中放于-20℃保存。
 
  
 
  2.組織中總蛋白的提取
 
  將少量組織塊置于1~2ml勻漿器中球狀部位,用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。
 
  加400μl單去污劑裂解液裂(含PMSF)于勻漿器中,進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。
 
  幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上,要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。
 
  裂解30min后,即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中,然后在4℃下12000 rpm離心5min,取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20℃保存。
 
  加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提取由于受藥物的影響,一些細(xì)胞脫落下來,所以除按1)操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。
 
  
 
  3.培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提取
 
  將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中,于2500 rpm離心5min。
 
  棄上清,加入4ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌,然后2500 rpm離心5min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。
 
  用槍洗干上清后,加100μl裂解液(含PMSF)冰上裂解30min,裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。
 
  將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm離心5min,取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20℃保存。
 
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